Мікробіом та метаболіти в пуерах. Витримка пуеру з точки зору науки. Повний переклад наукової статті (2016)

Поділись з друзями в соцмережах

Мікробіом та метаболіти в пуерах. Витримка пуеру з точки зору науки. Повний переклад наукової статті (2016).

🍀 СРІБНИЙ ЛЕЛЕКА – магазин автентичних чайників з їсінської глини від Династії Цин до 1990х років🍀
Срібний Лелека
Срібний Лелека

Передмова від Чайнатеки

Ця стаття — ковток свіжого повітря, бо фундаментальні, але невизначені знання про чай перетворюються на визначені. Результати досліджень ставлять крапки на «і» в питаннях витримки обох видів пуеру, участі свіжого чайного листя в якості кінцевого продукту, а також, що дуже важливо, в питанні шкідливості чаю Пуер. Висновки досліджень сміливо можна назвати постулатами і вони надважливі для нашої чайної спільноти, для її здорового та свідомого розвитку, а також розуміння природи чаю.

Українська чайна спільнота та культура тільки нещодавно ментально відокремилась від російської. Ми знаходимось на початку свого окремого шляху, але проблема в тому, що у нас досі побутують знання, які тісно переплітаються з маркетингом, міфами, легендами, невірним розумінням і трактуванням. І це в певному сенсі добре, бо дитина не одразу ходить. Задля справедливості треба зазначити, що чайні знання в інших країнах західної культури також потерпають від міфології та маркетології. Продавці заради наживи ладні вигадувати що завгодно, аби продати більше товару. Споживач, в свою чергу, часто сам хоче чути інформацію, після якої він зможе відчувати себе в колі «обраних». Це замкнуте коло, розірвати яке можуть тільки вчені.

В пошуках інформації доводиться читати як загальну літературу, включно з блогами, так і наукову. Поєднує їх чай, а розділяє — інформація про чай. Наведу приклад поняття «дикого» дерева. На сайтах, в посередніх книжках, в інтернет-магазинах, а частіше всього на обгортках чаю написано «дике дерево». В найгіршому випадку буде вказаний вік такого дикого дерева. Інша ситуація в науковій літературі, там дикість дерева завжди вказується умовно, оскільки визначити чи було воно посаджене людьми або виросло самостійно немає можливості. Тим паче, що «дикі» дерева ростуть в місцях постійного проживання людей. Тож послухаємо, що нам розкажуть вчені, а не продавці.

В переклад не були включені наступні розділи:
DNA extraction, amplification, and Sanger sequencing of plant gene fragments; Amplification and Illumina Miseq sequencing of fungal ITS and bacterial SSU fragments; Bioinformatics of high-throughput data; Statistical analysis of microbial community; Multiplex analysis of fungal and bacterial metabolites; Plant DNA fragment analyses in fresh leaves and Pu-erh tea samples. В цих розділах перелічуються всі використані патентовані методи отримання та обробки даних, кількісні показники матеріалу та різні етапи дослідження. Такі дані потрібні іншим вченим для тестування і порівняння даних в майбутніх дослідженнях.

Перекладена назва: Мікробіом і метаболіти у ферментованому чаї Пуер, виявлені за допомогою високопродуктивного секвенування та кількісного мультиплексного аналізу метаболітів.

Посилання на оригінал: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4918958/

Автори: Йонцзе Чжан, Іда Скаар, Майкл Сульок, Сінчжун Лю, Мін’юн Чао та Джон Тейлор. 2016 рік.

Анотація

Пуер — це чай, який виробляється в Юньнані, Китай, шляхом мікробного ферментування свіжого листя Camellia sinensis двома способами: традиційним ферментуванням (raw puerh; шен пуер) та швидким ферментуванням (ripe puerh; шу пуер). Ми визначили грибні та бактеріальні спільноти у свіжому листі та обох видах Пуеру за допомогою секвенування ампліконів (амплікон — це фрагмент ДНК, який є продуктом реплікації, тобто утвореної копії) рДНК високої пропускної здатності, а також профіль біоактивних мікотоксинів у чаях Пуер за допомогою кількісної рідинної хроматограф-тандемної мас-спектрометрії. Ми ідентифікували 390 грибкових та 629 бактеріальних OTU у свіжому листі та обох видах Пуера. Було виявлено 25 токсичних метаболітів, головним чином грибкового походження, серед яких переважають патулін та асперглауцид, що узгоджує китайську традицію виливати перший пролив Пуеру і використовувати зволожений чай для подальшого приготування напою.

Основні висновки:

Грибкове різноманіття знижується, а бактеріальне різноманіття зростає під час традиційного або швидкого ферментування.

Склад грибкової та бактеріальної спільнот значно змінюється між свіжим листям та обома видами Пуеру.

Витримка спричиняє значні зміни у мікробній спільноті Шен пуеру, але не Шу.

Шу пуер та добре витриманий Шен пуер мають подібні мікробні спільноти, які відрізняються від тих, що є у молодого Шен пуеру.

OTU або Operational Taxonomic Unit, а далі ОТО, тобто Операційна Таксономічна Одиниця — це термін, який використовується для опису групи організмів, які часто класифікуються разом на основі подібності їх генетичного матеріалу. Якщо просто, то це спосіб групувати мікроорганізми, як-от бактерії, на основі подібності їх ДНК.

Вступ

Чай є одним з найпопулярніших напоїв у світі. Він зазвичай виробляється з листя двох різновидів чайної рослини, Camellia sinensis var. sinensis та var. assamica. Чай має важливі фізіологічні ефекти на споживачів завдяки наявності таких сполук, як поліфеноли, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи, кофеїн та пуринові алкалоїди, які можуть бути корисними для здоров’я. Серед заявлених ефектів споживання чаю є зниження рівня ліпідів у крові, антимікробна, антиоксидантна та антиканцерогенна активність, а також поліпшення травлення та зменшення ваги тіла. Залежно від способів обробки чай можна розділити на щонайменше шість різних типів: зелений, жовтий, білий, улун, чорний (у Китаї називають червоним) та постферментований чай (у Китаї називають темним чаєм). Серед них постферментований чай є унікальним саме через процес мікробного ферментування, який може тривати від кількох місяців до багатьох років. До постферментованих китайських чаїв належать Фу-Чжуан з Хунані, Цин Чжуан з Хубеї, Лю Бао з Гуансі та Пуер з Юньнані, останній з яких є найвідомішим за свій смак та політичну економіку.

Чай Пуер виготовляють з C. sinensis var. assamica з часів династії Тан (618-906 рр. н. е.). Існує два типи: природно ферментований (raw; сирий; шен) та спеціально або швидко ферментований (ripe; шу). Для Шен пуеру початкова обробка починається з підв’ялювання свіжих чайних листків природним способом, наступним етапом є обсмаження листків з подальшим висиханням для зміни властивостей рослинних ферментів, скручування листків для видалення додаткової вологи та окиснення, і, нарешті, завершення процесу — сушіння на сонці (примітка від перекладача: автори зробили опис так званого Мао Ча, оскільки для того, щоб Шен пуер став Шен пуером його потрібно спресувати, біохімія цього процесу описана в статі Біохімія чаю Пуер. Як пуер стає пуером з точки зору науки. Повний переклад наукової статті (2016), також це регулюється стандартом gb/t22111). Потім Шен пуер витримується протягом різних періодів для сприяння природній твердофазній ферментації. Якість та смак Шен пуеру до певної міри покращуються з часом, і, відповідно, витриманий Шен пуер є більш цінним. Шу пуер, який був розроблений у 1970-х роках для скорочення часу старіння, виготовляється так само, як Шен пуер, але з додатковим кроком, який називається «ферментація в купах», з додаванням води та/або мікробів для сприяння мікробній ферментації. Готовий чай Пуер, як Шен, так і Шу, може залишатися у вигляді розсипного листя або стискатися у форми для полегшення транспортування та зберігання.

Виробництво та якість Пуеру тісно пов’язані з мікробною активністю, що робить важливим розуміння мікробіому Пуеру. Попередні дослідження вивчали гриби та/або бактерії, що виникають під час ферментації в купах Шу пуеру, використовуючи:

культурно-залежні методи (методи, які використовуються для виділення та культивування мікроорганізмів у лабораторних контрольованих умовах);

методи першого покоління, незалежні від культури, такі як денатураційний градієнтний гель-електрофорез та секвенування клонів за методом Сенгера;

метагеномне секвенування.

Aspergillus niger та Blastobotrys adeninivorans часто документувалися як домінуючі лінії у Пуері, як у культурно-залежних дослідженнях, так і у культурно-незалежних дослідженнях. Деякі інші дослідження вивчали мікробне різноманіття у Пуерах різного віку, але жодне з них не зробило опис мікробних спільнот свіжого листя, Шен пуеру та Шу пуеру, а також не намагалося пов’язати склад бактеріальних та грибкових спільнот з екологічними факторами (наприклад, тип та вік чаю, виробник чаю).

Як продукт мікробного ферментування, безпека чаю Пуер є темою постійного занепокоєння. Токсичні мікробні метаболіти досліджувалися у зразках чаю Пуер або у грибкових ізолятах, отриманих з Пуеру, але в літературі були знайдені непослідовні результати. Деякі дослідження взагалі не виявили мікотоксинів, але інші виявили мікотоксини, такі як афлатоксин B1, деоксиніваленол та охратоксин А. Також попередні дослідження не пов’язували склад мікробних спільнот з виробництвом потенційно токсичних мікробних метаболітів.

Нещодавні досягнення у технологіях масового паралельного короткого ампліфікованого секвенування зробили прорив у дослідженнях мікробної екології ферментації вина, молока та інших продуктів. Ми застосували секвенування ампліконів високої пропускної здатності для дослідження мікробіому у свіжому чайному листі, Шен та Шу пуерах, а потім провели мультиплексний аналіз метаболітів у зразках чаю. Наші цілі були:

ідентифікувати мікробне різноманіття та склад у Пуерах;

порівняти структуру мікробних спільнот між свіжим чайним листям, Шен та Шу пуерами;

виявити потенційні фактори, що впливають на мікробні спільноти у чаї Пуер,

виявити мікробні метаболіти у чаї Пуер.

Зразки, використані в цьому дослідженні

Було досліджено сім зразків свіжого листя Camellia sinensis var. assamica та 31 зразок чаю Пуер (Таблиця A). Свіже листя збирали в трьох різних чайних садах, розташованих у місті Пуер провінції Юньнань на південному заході Китаю. 31 зразок чаю, 15 Шен пуерів та 16 Шу пуерів, було зібрано з п’яти різних компаній у місті Пуер, які зберігалися протягом 0–28 років (шен) та 0–13 років (шу) (Таблиця A). Вони були або розсипними, або стиснутими у формі дисків чи цеглинок. Усі зразки піддавалися високопродуктивному секвенуванню. Також було проаналізовано грибкові та бактеріальні біоактивні речовини у 31 зразку чаю.

Додаток
: Автори дослідження не вказали, який саме вони взяли Шен пуер для досліджень: витриманий у сухому складі чи вологому (традиційному). Для китайського читача або спеціаліста це не буде проблемою, оскільки він точно знає, що в місті Пуер витримка буде виключно традиційна. Як би автори взяли зразки зі складів в Куньміні, то це б означало, що зберігання сухе. Шен пуер сухого та вологого зберігання має різні арома-смакові профілі, різний колір та властивості. В Шен пуері сухого зберігання, це той, що зазвичай на полицях українських магазинів, зміни відбуваються майже непомітно.

Результати

Різноманітність таксонів мікроорганізмів та склад спільнот

Ми успішно ампліфікували та секвенували ДНК грибкових та бактеріальних спільнот з усіх зразків. Після видалення праймерів та низькоякісних кінців, об’єднання парних прочитань та демультиплексування, кожен зразок надав більше 42 383 послідовностей грибкових ITS (7 587 458 загалом) та 29 721 послідовностей бактеріальних SSU (6 949 251 загалом). Подальша обробка для видалення одиничних послідовностей, химер, нетаргетних послідовностей та ОТО з низькою чисельністю зменшила кількість до між 39 507 та 214 960 грибкових послідовностей на зразок (7 305 834 загалом) та між 66 та 305 472 бактеріальних послідовностей на зразок (2 413 213 загалом).

Низька кількість бактеріальних послідовностей, виявлених у зразках свіжого листя та деяких Шен пуерах, була обумовлена ампліфікацією конкуруючої ДНК хлоропластів SSU, яка складала 86,23% у зразках свіжого листя та 65,81% у зразках Шен пуеру, порівняно з лише 0,09% у зразках Шу пуеру (Рисунок C).
послідовності хлоропластів були виключені перед подальшим аналізом. Кінцева кількість ОТО, що пройшли фільтрацію чисельності (на рівні 0,005%), склала 390 для грибів (65 до 175 ОТО на зразок) та 629 для бактерій (18 до 466 ОТО на зразок з нижчими числами у свіжому листі та Шен пуері).

Найбільш поширеними грибковими таксонами були Ascomycota (305 ОТО; 91,67% загальної кількості послідовностей); найбільш поширеними бактеріальними таксонами були Firmicutes (220 ОТО; 37,01% загальної кількості послідовностей), Actinobacteria (172 ОТО; 43,16%), та Proteobacteria (158 ОТО; 13,89%) (Рисунок D).

Парні прочитування — це підхід у секвенуванні ДНК, при якому обидва кінці фрагмента ДНК секвенуються незалежно.
Демультиплексування — це процес обробки даних секвенування
ITS; Internal Transcribed Spacer (внутрішня транскрибована прокладка) — частина некодуючої ДНК, яка знаходиться між генами рибосомної РНК (рРНК) в геномі.
SSU;Small Subunit (мала субодиниця) — мала субодиниця рибосоми, яка складається з рибосомної РНК (рРНК) і білків.

Порівняння мікробних спільнот у свіжих листях, Шен та Шу пуерах.

При використанні всіх послідовностей близько 1/4 грибкових ОТО (107/390) та 1/6 бактеріальних ОТО (107/629) були спільними для трьох типів зразків (Рисунок 1(a) та 1(б) ), що вказує на значну варіацію у складі спільнот між типами зразків. При порівнянні ОТО між свіжими листками та Пуерами 54% грибкових ОТО (173/318) або 22% бактеріальних ОТО (138/625), присутніх у Пуері, також виявлялися у зразках свіжого листя (Рисунок 1(a) та 1(б) ), що свідчить про те, що свіже листя є важливим мікробним резервуаром для ферментації Пуеру. При порівнянні Шен та Шу пуерів 62% грибкових ОТО (196/318) та 50% бактеріальних ОТО (310/625) були спільними. Щоб оцінити вплив на подібність мікробних спільнот численних рідкісних ОТО, виявлених у кожному типі зразків, ми проаналізували ОТО, спільні для типів зразків, використовуючи лише 100 найбільш поширених грибів і бактерій. Зосередившись на цих найпоширеніших мікроорганізмах, частка спільних грибкових і бактеріальних ОТО різко зросла (наприклад, з 17–27% до 37-51%для спільних ОТО трьох типів), незалежно від того, чи порівнювалися всі три типи або будь-які два типи (Рисунок 1(в) та 1(г) ).

Перевірка альфа-розмаїття після розріджування до однакової глибини секвенування

Після розріджування до однакової глибини секвенування, свіжі листя мали більше грибкових ОТО, але менше бактеріальних ОТО, ніж чай Пуер (Рисунок 2, Графік Б). Для грибів різниця між свіжими листками та Пуером була значною за індексами альфа-розмаїття (Досліджувані види, Chao1, Shannon та Simpson-e), тоді як різниця між Шен та Шу пуерами не була значною (Рисунок E(а-г) ). Для бактерій Шу пуер показав значно більшу різноманітність видів, ніж свіжі листки або Шен пуер, за оцінками Досліджуваних видів або Chao1, але не за індексами Shannon або Simpson-e (Рисунок E(д-ж) ).

Бета-розмаїття

Різниці у мікробних спільнотах між свіжими листками, Шен та Шу пуерами були високо значущими у тестах ANOSIM і ADONIS з використанням оцінок бета-розмаїття за Binary-Jaccard і Bray-Curtis. Загальна різниця спільнот між типами зразків була на рівні 20-40%. Подібні результати були також візуалізовані у графіках PCoA (Рисунок 3) та NMDS (Рисунок F). Найбільш цікаво, що найстаріший зразок Шен пуеру (A6) мав тенденцію до групування зі зразками Шу пуеру, особливо при розгляді грибкової спільноти (Рисунок 3(а) ). Найстаріший зразок Шен пуеру (A6, 28 років), позначений стрілкою в обох аналізах PCoA, більше схожий на Шу пуер, ніж на інші зразки Шен пуеру.

Багато індикаторних таксонів були знайдені для зразків свіжого листя, Шен та Шу пуерів (Таблиця 2). Як і очікувалося, лінії термофільних або термостійких грибів (наприклад, Rhizomucor pusillus та Thermomyces lanuginosus) та бактерій (наприклад, Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans та Tuberibacillus calidus) були серед індикаторних таксонів, знайдених у зразках Шу пуеру (Таблиця B)(Таблиця В не підлягає перекладу, оскільки містить повний перелік виявлених мікроорганізмів, вона буде прикріплена в кінці статті). Два індикаторні таксони, знайдені для Пуеру (Шен та Шу), Aspergillus niger та Blastobotrys adeninivorans, вважаються домінуючими грибковими лініями в Пуері за даними як культурно-залежних, так і культурно-незалежних досліджень .

Вплив змінних на різницю між мікробними спільнотами в пуері

Дослідження чотирьох змінних

Ми досліджували чотири змінні (вік, виробник, чистий чай проти чаю, забрудненого іншими рослинами, та розсипний проти пресованого чаю), щоб з’ясувати, чи можуть вони допомогти пояснити різницю в мікробній спільноті між Шен та Шу пуерами.. Для дослідження впливу старіння ми розділили наші зразки Шен та Шу пуерів на дві (молодий та старий) або три (молодий, середнього віку та старий) вікові групи (Таблиця А). Серед цих змінних тільки вік чаю і тільки для Шен пуеру показав статистично значущий (істотний) ефект за допомогою щонайменше двох методів оцінки бета-розмаїття та двох методів порівняння (ANOSIM та ADONIS), (Таблиця С).

Кореляція між грибковими та бактеріальними спільнотами

Тест Мантеля був використаний для перевірки кореляції між грибковими та бактеріальними спільнотами. Ми не виявили кореляції між спільнотами двох типів мікробів у Шен пуері на основі матриць відстаней як Binary-Jaccard, так і Bray-Curtis (Таблиця D). Ми виявили значущу кореляцію для двох типів спільнот у Шу пуері, використовуючи матриці відстаней Bray-Curtis для всіх 16 зразків (r = 0.410, P = 0.004), але не використовуючи матриці відстаней Binary-Jaccard або коли виключали сім зразків Шу пуерів, забруднених різними рослинами (Таблиця D).

Мікотоксигенні гриби та мікотоксини в Пуерах

Враховуючи, що звичайні та поширені гриби більш ймовірно можуть становити потенційну мікотоксичну загрозу для споживачів, ми зменшили кількість грибів до набору з 15 найпоширеніших ОТО у зразках, тобто у свіжих листях, Шен та Шу пуерах. Ці домінуючі грибкові таксони були знайдені майже у всіх таких зразках (Таблиця 3), де вони складали від 68% до 95% від загальної кількості послідовностей. Деякі з грибів, знайдених у наших зразках Пуеру, відомі як виробники мікотоксинів, такі як Aspergillus niger [59], Aspergillus restrictus [60] та Penicillium citrinum [61]. Можливо, деякі бактерії в Пуері виробляють токсини, але бактеріальні токсини не розглядалися в цьому дослідженні. На щастя, деякі часто документовані роди бактерій, що виробляють токсини, такі як Clostridium, Escherichia, Vibrio та Salmonella [62], не були виявлені у наших зразках Пуерів (Таблиця E).

Виявлення мікотоксинів методом LC-MS/MS

Всі зразки чаю були досліджені на наявність мікотоксинів за допомогою рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Загалом було виявлено 25 сполук, більшість з них у низьких концентраціях:Alternariolmethylether(Альтернатіолметилетер), Andrastin A (Андрастин A), Asperglaucide (Асперглауцид), Aspterric acid (Асптеррична кислота), Brevianamid F (Бревіанамід F), Chlorocitreorosein (Хлороцитрерозин), Citreorosein (Цитрерозин), Cladosporin (Кладоспорин), Cyclo(L-Pro-L-Tyr) (Цикло(L-Pro-L-Tyr) він же Макулозин), Emodin (Емодин), Festuclavine (Фестуклавін), Fumigaclavine A (Фумігаклавін A), Fumigaclavine C (Фумігаклавін C), Lotaustralin (Лотавстралін), Malformin C (Малформін C), Methylsulochrin (Метилсулохрін), Mycophenolic acid (Мікофенолова кислота), Neoechinulin A (Неоехінулін A), Patulin (Патулін), Physcion (Фізціон), Quinocitrinin (Кіноцитринін), Rugulusovin (Ругулусовін), Skyrin (Скирін), Usnic acid (Уснінова кислота) and Zearalenone (Зеараленон)(Рисунок 4).

П’ять сполук були виявлені у всіх зразках чаю: Asperglaucide (Асперглауцид), Brevianamide (Бревіанамід F), Emodin (Емодин), Neoechinulin A (Неоехінулін A) та Usnic acid (Уснінова кислота); асперглауцид був присутній у найвищій концентрації серед всіх мікотоксинів як у Шен (середня концентрація 6596 μг/кг), так і у Шу(6799 μг/кг) пуерах. Фестуклавін, фумігаклавін A, метилсулохрін, хлороцитрерозин та скирін були виявлені тільки у зразках Шу пуерів, тоді як лотавстралін був знайдений тільки у зразках Шен пуерів. Патулін був виявлений у 9 (середня концентрація 1169 μг/кг) з 15 зразків Шен пуерів і лише у 2 (915 μг/кг) з 16 зразків Шу пуерів. Макулозин був виявлений у високих концентраціях у всіх зразках Шу пуерів (735–2825 μг/кг), але у низьких концентраціях лише деяких зразках Шен пуерів (76–533 μг/кг).

Обговорення

Використовуючи секвенування нового покоління ДНК, ізольованої з Пуерів, ми виявили набагато більше OTО (операційних таксономічних одиниць) на рівні видів — 390 грибкових та 600 бактеріальних, ніж у попередніх дослідженнях. Наприклад, в дослідженні Tian J, Zhu Z, Wu B, Wang L, Liu X. «Bacterial and fungal communities in Pu’er tea samples of different ages» для виявлення близько 20 грибкових та 30 бактеріальних OTО з 19 зразків Пуеру використали методи, що залежать від культури та градієнтного гелевого електрофорезу . В дослідженні Zhao ZJ, Tong HR, Zhou L, Wang EX, Liu QJ. «Fungal colonization of Pu-erh tea in Yunnan» використали метод розведеного плакування (примітка: нанесення на пластину тонкого шару дослідного матеріалу) для виявлення 41 грибкового виду з 60 зразків Пуеру . Кілька грибків було ідентифіковано в чаї Пуер шляхом культивування. Aspergillus niger, важливий промисловий гриб, було визнано основним грибом для ферментації Пуерів. Ми знайшли цей гриб у всіх зразках Шен та Шу пуерів, і його відносна кількість була більшою у Шу пуері (друга найпоширеніша OTО, 16,1% послідовностей), ніж у Шен пуері (15-та найпоширеніша OTО, 1,4% послідовностей) (Таблиця 3).

У Шен пуері найбільш домінуючим грибковим таксоном був невизначений Aspergillus sp. (24,6%). У Шу пуері найпоширенішим грибковим видом був Blastobotrys adeninivorans (46,5%), який у Шен пуері був третім за поширеністю грибом (Таблиця 3). Blastobotrys adeninivorans, ще один гриб з біотехнологічним інтересом , часто ізолювався з Пуеру іншими дослідниками . Деякі грибкові види, про які часто повідомлялося раніше, такі як Penicillium chrysogenum та Yarrowia spp. , не були знайдені в нашому дослідженні.

Ми не можемо сказати, чи обумовлені відмінності між нашим методом нового покоління та попередніми дослідженнями життєздатністю грибів, швидкістю росту, наявності ДНК або ефективності ампліфікації, але всі чотири аспекти були залучені. Неповна референтна база даних, використана для присвоєння таксономії є ще одним важливим фактором, оскільки 38% (148/390) грибкових OTО не були присвоєні до жодного виду.

Одним з наших основних висновків є те, що альфа-різноманіття грибів вище у свіжому чайному листі, ніж у Пуерах, а альфа-різноманіття бактерій показує протилежну тенденцію — тобто нижче у свіжому листі, ніж у Пуерах (Рисунок 3; Рисунок E (д-ж)). Що стосується бактерій, то різниця в альфа-різноманітті між листям і чаєм була помітна у Шу, але не у Шен пуері (Рисунок E (д-ж)), що вказує на те, що твердофазна ферментація відповідальна за це збільшення.

Другий основний висновок полягає в тому, що склад як грибкових, так і бактеріальних спільнот значно змінюється внаслідок ферментації Пуеру, як показано значними відмінностями бета-різноманіття для обох спільнот у попарних порівняннях між свіжим листям, Шен та Шу пуерами (Таблиця 1). Причини цих відмінностей мають бути пов’язані з мікроорганізмами, що присутні у свіжих листях порівняно з тими, що додаються (примітка: з повітря; предметів; землі тощо) під час обробки та ферментації. Свіжі листя містять послідовності, що представляють близько 54% грибкових OTО та 22% бактеріальних OTО, знайдених у Пуерах (Рисунок 1). Ці OTО зазвичай існували у низькій кількості у свіжому листі і але зазнали розмноження у Пуерах. Решта грибкових та бактеріальних OTО, знайдених у Пуерах, мають походження під час процесів виробництва, які дозволяють введення мікроорганізмів з навколишнього середовища, наприклад, інструменти, кімната для ферментації та руки робітників.

Цікавим висновком є те, що найбільш цінний чай — витриманий Шен пуер, має грибкову спільноту схожу на Шу пуер, а не на молодий Шен пуер, і подібна тенденція спостерігалася для бактеріальної спільноти (
Рисунок 3). Цей результат вказує на те, що прискорена мікробна ферментація Шу пуеру, якій сприяє додавання води та тепло, що генерується мікробною ферментацією, призводить до поширення мікробної спільноти, схожої на ту, що знайдено у набагато старшому Шен пуері. Це також надає екологічне пояснення швидкого прийняття та виробництва Шу пуеру.

Ми шукали кореляції між чотирма змінними у виробництві чаю та складом мікробної спільноти: віком чаю, виробником чаю, чи був чай чистим або забрудненим іншими рослинами, і чи був чай розсипним або спресованим у диски. Вік чаю показав значну кореляцію зі складом грибкової та бактеріальної спільноти лише для Шен пуеру (Таблиця C). З цього результату можна зробити висновок, що витримка Шен пуер є стабільним, але довгим методом виготовлення продукту, а виготовлення Шу пуеру є більш вимогливим процесом, але його подальша якість не залежить від витримки. Цей результат також може підтверджувати припущення, що тривале транспортування Шен пуеру з Юньнані до Тибету та інших віддалених місць у стародавні часи сприяв його дозріванню . Витримка незначно впливає на грибні та бактеріальні спільноти Шу пуеру, що свідчить про те, що витримка Шу пуеру є непотрібною. Інші три змінні не мали значного впливу на мікробні спільноти (Таблиця C).

Хоча чай Пуер вважається безпечним напоєм для вживання протягом сотень років, без повідомлень про отруєння, але якість та безпека будь-якого продукту, що пройшов мікробну ферментацію, є темами постійного інтересу та занепокоєння. Серед сполук, виявлених у Пуері в цьому дослідженні, найбільш поширеним був Asperglaucide (Асперглауцид) (Рисунок 4), який був виявлений у всіх зразках та у високих кількостях у Шен (6596 μг/кг) та Шу (6799 μг/кг) пуерах. Цей метаболіт виробляється видами Aspergillus, включно з Aspergillus penicillioides , який був виявлений у всіх зразках (Таблиця 3).

Також повідомляється, що він виявлений у деяких рослинах, наприклад, Walsura yunnanensis. Асперглауцид має протизапальну дію та здатність інгібувати цистеїнові пептидази , що може бути корисним для захисту від дегенерації хряща. Також виявлений у всіх зразках був Neoechinulin A (Неоехінулін А), який має протизапальну дію і може вироблятися деякими видами Eurotium. Fumigaclavine А (Фумігаклавін А), антибактеріальний алкалоїд, що виробляється Aspergillus spp., був виявлений лише у Шу пуері, тоді як Lotaustralin (Лотаустралін), попередник Ціаністого водню , був виявлений у всіх зразках Шен пуеру, але не у зразках Шу пуеру.

Фунгіцид Cyclo(L-Pro-L-Tyr) він же Макулозин, що виробляється Lysobacter capsici та Alternaria alternata , був виявлений у 60% зразків Шен пуеру та 100% Шу пуеру. Такий розподіл також був характерним для Rugulusovin (Ругулусовін), який виробляється видами Penicillium і має цитотоксичну дію на ракові клітини людей та мишей. Він був виявлений у половині Шен та у всіх Шу пуерах.

Patulin (Патулін) був виявлений у 60% зразків Шен пуеру із середньою концентрацією 1169 μг/кг, та лише у 12,5% зразків Шу пуеру із середньою концентрацією 915 μг/кг. Патулін викликає занепокоєння, оскільки він виробляється великою кількістю грибків і підозрюється у класто-, мута-, терато-, гено- та цитотоксичності. Управління з контролю за продуктами та ліками США (FDA) встановило верхню межу в 50 μг/кг для патуліну в яблучному соці та яблучних сокових концентратах. Хоча концентрація патуліну буде нижчою у чашці правильно завареного чаю, але все одно ці показники будуть перевищувати межу, встановлену FDA.

Хоча ми виявили патулін у Пуері, ми не знаємо його джерела. Відомими виробниками патуліну є Penicillium spp. (P. expansum, P. griseofulvum, P. carneum, P. glandicola, P. coprobium, P. vulpinum, P. clavigenum, та P. concentricum), Aspergillus spp. (A. clavatus, A. giganteus та A. terreus), Paecilomyces variotii та Byssochlamys nivea. Однак жоден з цих видів не був виявлений у наших зразках чаю. Тому, ймовірно, що у чаї присутні види, які ще не були відомі як продуценти патуліну. Навпаки, ми знайшли грибкові види, які можуть виробляти Ochratoxin А(Охратоксин A) (Aspergillus niger у всіх зразках та A. ochraceus у шести зразках Шу пуеру), але сам охратоксин A не був виявлений. Цей результат відповідає дослідженню Mogensen JM, Varga J, Thrane U, Frisvad JC. «Aspergillus acidus from Puerh tea and black tea does not produce ochratoxin A and fumonisin B2», під час якого не знайшли охратоксину A у 5 досліджених зразках Пуеру, але відрізняється від дослідження Haas D, Pfeifer B, Reiterich C, Partenheimer R, Reck B, Buzina W. «Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea», в якому виявили охратоксин A у 4 з 36 зразків Пуеру.

У даному дослідженні невелика кількість Zearalenone (Зеараленону) була виявлена лише в одному зразку, тоді як Aflatoxin (Афлатоксин), Fumonisin(Фумонізин) або Trichothecene (Трихотецен) не були виявлені. Хаас та інші не знайшли афлатоксини або фумонізини у 36 досліджених зразках Пуеру . Ву та інші досліджували 70 зразків Пуеру і виявили, що всі зразки чаю були безпечними щодо фумонізину B1 та токсину Т-2, однак 8 зразків мали вищі концентрації афлатоксину B1, ніж межа безпеки, та 63 зразки перевищували межу безпеки для Deoxynivalenol (Дезоксиніваленолу).

Поясненням виявлення грибів, здатних виробляти мікотоксини, але не виявлення самих токсинів, може бути недавній звіт, що екстракти чаю інгібували вироблення афлатоксинів Aspergillus flavus, але не інгібували ріст міцелію гриба. Інгібування вироблення мікотоксинів без інгібування росту грибів також було повідомлено для інших рослин, крім чаю. Ця ситуація може бути справедливою також і для охратоксину. Як зазначено вище, для безпечного вживання Пуеру більшість виробників або дистриб’юторів Пуеру рекомендують виливати першу заварку (пролив). Це зменшує кількість «забруднювачів», що розчинені у воді або знаходяться у стані суспензії, тобто ті, що знаходяться на поверхні чаю, але не утворюють з ним сполук.

Висновки

Секвенування нового покоління виявило високу грибкову та бактеріальну різноманітність у чаях Пуер. Грибкова різноманітність знижується, а бактеріальна зростає внаслідок ферментації Шен або Шу пуерів. При цьому витриманий Шен пуер має подібну спільноту до Шу пуеру. Вік чаю визначено як значну змінну, що впливає на мікробну спільноту Шен пуеру, але не Шу. Було виявлено кілька мікотоксинів в одній з обох або обох категоріях Пуеру, але всі, крім патуліну та асперглауциду, були в безпечних межах. Для безпечного вживання ми рекомендуємо виливати першу заварку. (примітка від автору перекладу: безпечне вживання коректно назвати умовним безпечним вживанням, оскільки автори дослідження тільки припускають це твердження без ґрунтовних доказів на основі своїх або інших досліджень)

Додаток від Чайнатеки

Перелік фактів, виявлених в дослідженні Мікробіом та метаболіти в пуерах. Витримка пуеру з точки зору науки

1) Свіже чайне листя містить певний набір грибних та бактеріальних спільнот, які розмножуються під час виготовлення та ферментації Пуерів. Тобто свіжий лист слугує природним контейнером мікробіологічних спільнот, від яких залежить подальший результат. З цього можна зробити висновок, що якісний Шен пуер може бути виготовлений тільки з деревного листя, оскільки дерева не оприскують речовинами від шкідників, що в свою чергу не порушує природну мікрофлору листя. Це може не стосуватися Шу пуерів, оскільки потрібні мікроорганізми додаються штучно під час ферментації в «купах». Це одна з причин, чому компанії, що займаються витримкою Шен пуерів не розглядають чай з куща для витримки, якщо не брати до уваги інші аспекти (мінеральна, поліфенольна та інші складові листя).

2) Витриманий Шен пуер традиційної (вологої) витримки за профілем більше схожий на Шу пуер, ніж на молодий Шен пуер. За ферментацію обох відповідають мікроби на гриби.

3) Питання витримки Шен пуерів. Результати дослідження чітко показують, що витримка — це зберігання чаю в контрольованих умовах і ще дуже важливо. Оскільки витримка є синонімом слова постферментація, а за витримку відповідають мікроорганізми, то для підтримки їх життєдіяльності потрібні умови, такі як постійна температура, вологість, мікрофлора навколишнього середовища тощо. Якщо взяти диск пуеру з місця постійного зберігання, покласти в коробку і відправити в Україну в холодному або спекотному контейнері корабля, то який буде результат, навіть якщо знову відтворити вихідні умови? Сам факт тимчасової відсутності необхідних умов порушує процес, а для подальшої підтримки потрібна така ж сама мікрофлора. Як приклад дисбактеріоз кишківника або шкіри. Завжди на тілі або всередині тіла є бактерії, які вважаються умовно патогенними, як тільки через будь які причини норма порушується, то «умовні» стають дійсно патогенними. І якщо з цим нічого не робити, то зазвичай такий дисбаланс призводить до наслідків. Пуер також живий організм, точніше місце проживання для багатьох біологічних спільнот, які до певного часу не мають дисбалансу і просто виконують свою роботу. Ще раз: старий шен пуер не є витриманим, а вік чаю не є показником якості або витриманості. У китайців є доречний вислів на цю тему: «Якщо зберігати сміття 20 років, то через 20 років воно залишиться сміттям».

4) Результати досліджень поставили крапку в питанні витриманих шу пуерів. Звучить це так: подальша витримка Шу пуерів зі ступенем ферментації в 100%, як це зазвичай буває у фабрик для масспоживу, не має сенсу, оскільки всі процеси відбуваються під час ферментації «в купах» і зупиняються одразу після завершення цієї ферментації. Але є вийнятки, оскільки для подальшої витримки можна використовувати пуер 50-70% ферментації, де процес ще відбувається.

5) Токсини. Дійсно, виявлення патуліну в кількостях, що перевищують межові допустимі норми в 20 разів, має викликати занепокоєння. Патулін — дуже токсична речовина, канцероген, а також може порушувати ДНК. Мені здалося дивним, що вчені не приділили цьому достатньої уваги, хоча могли зробили порівняльний тест вмісту у сухому чаї та завареному, натомість скромно рекомендували «правильно заварювати чай». Яка має бути правильність заварювання залишається невідомим. Давайте розберемось в цьому питанні самостійно.

Цей мікотоксин і справді може знаходитись в стані суспензії, тобто «лежати» на поверхні чаю, без утворень сполук, в такому разі доцільним буде злити перший пролив, і не просто зволоживши, а декілька разів перемішавши. Для заспокоєння можна зробити таку процедуру двічі. Інше питання взагалі в екстракції патуліну з чаю, якщо він не на поверхні, а зв’язаний з чаєм. Якщо умовно в одній порції чаю міститься 10 грамів патуліну, то яка кількість екстрагується в сам чай?

Інше питання полягає взагалі в доречності хвилювання, адже патулін міститься у фруктах, особливо в тих, що залежались, та навіть у соках. А
ле давайте про патулін в Пуері та математику!

В цьому дослідженні була виявлена концентрація токсина Патулін, що перевищувала допустиму норму для харчових продуктів у 20 разів, тобто його вміст складав від 912 до 1169 мкг/кг чаю Пуер. Як би це не звучало дивно, але науковці випустили з уваги один важливий момент. Мова про допустиму або/та шкідливу концентрацію токсину на масу тіла.

Для миші безпечна доза складає 43 мкг/кг маси тіла за рівнем NOAEL. Для розрахунку візьмемо найвищу концентрацію в Пуері ~1200 мкг/кг, що приблизно дорівнює 400 мкг для одного стандартного диску Пуеру (357 грамів), або ~6 мкг для одного чаювання. Розрахована доза патуліну для одного чаювання менша за безпечний показник для миші всемеро. Канцерогенність Пуеру скасовується.

Читайте по темі:
Біохімія чаю Пуер. Як пуер стає пуером з точки зору науки. Повний переклад наукової статті (2016).